家禽传染病的病原学诊断:细菌培养和初步鉴定

日期:2019-11-29编辑作者:行业新闻

  

  (1)染色镜检

  

  ①抹片的制备

  

  固体培养物(平板、斜面)或脓汁、粪便等抹片的制备:用接种环取生理盐水1滴,置于准备好的载玻片上,再用灭菌接种环取培养物少许混合于水滴中,混匀涂成薄膜,使其呈极轻微的乳浊为度,多余材料在火焰上灭菌。

  

  液体培养物或血液、尿液、渗出液、乳汁等抹片的制备:直接用灭菌接种环取1环或数环待检材料,置于玻片上制成涂片。

  

  组织、脏器材料触片的制备:取病料组织一小块,以其切面在玻片表面轻轻接触几次,注意不宜触重、过厚,任其自然干燥,即成组织触片(或称印片)。也可用其切面轻轻接触玻片表面并移动组织块制成抹片,自然干燥。

  

  ②干燥固定:抹片(触片)于室温自然干燥后,将涂抹面朝上,以其背面在酒精灯火焰上通过数次,略作加热(但不能太热,以不烫手背为度)进行固定。血液、组织、脏器等抹片(尤其作姬姆萨染色)常用甲醇固定,可将已干燥的抹片浸入含有甲醇的染色缸内,取出晾干,或在抹片上滴加数滴甲醇使其作用3~5分钟后,自然干燥。

  

  ③染色:固定好的涂片或抹片即可进行染色。常规染色法有革兰氏染色法。基本过程是:染色→媒染→脱色→复染→干燥→镜检。

  

  染色 在已干燥固定好的抹片上滴加草酸铵结晶紫溶液于涂、抹面上,染色2~3分钟,水洗。

  

  媒染 滴加革兰氏碘液作用2~3分钟,水洗。

  

  脱色 滴加95%酒精于抹片上,脱色时间应根据涂抹面的厚度灵活掌握,多在20~60秒之间,水洗。

  

  复染 加稀释石炭酸复红溶液或沙黄水溶液数滴,染色1~2分钟,水洗。

  

  干燥 吸水纸吸干或自然干燥。镜检 显微镜使用时应放置在便于采光(电光源显微镜除外)而平稳的实验桌或实验台上。尽量升高聚光器,放大光圈,调节反光镜,便射入镜头的光线最强。

  

  于标本片的欲检部位,滴加香柏油1滴,将标本片固定于载物台正中,用油镜检查。首先眼睛从镜筒旁侧注视油镜头。小心转动粗调节器,使载玻片和镜筒靠近,直至油镜头浸没油中,几乎与玻片相接触,但不要碰到玻片。然后,一面从目镜观察,一面徐徐转动粗调节器使镜筒和载玻片的距离缓慢变远,待得到模糊物像时,再换用细调节器,直至物像完全清晰为止。此时,切勿用粗调节器使油镜头和载玻片靠近,以免压碎玻片,损坏油镜头。油镜用毕,应以擦镜纸拭去镜头上的香柏油。

  

  革兰氏阳性菌染成蓝紫色,革兰氏阴性菌染成红色。

  

  (2)划线分离

  

  右手持接种环于酒精灯上烧灼灭菌,冷却后,无菌操作取病料,若为液体病料,可直接用灭菌的接种环取病料一环;若为固体病料,首先将烙刀在酒精灯上灭菌,并立即用其将病料表面烧烙灭菌,然后用灭菌接种环从烧烙部位伸到组织中取内部病料。

  

  左手持平皿,用拇指、食指及中指将皿盖打开一侧(角度大小以能顺利划线为宜,但以角度小为佳,以免空气中细菌污染培养基),将已取被检材料的接种环伸入平皿,并涂于培养基一侧,然后自涂抹处以腕力在平板表面轻轻地分区划线,可间断划线,也可连续划线,第一组作1~3次划线,环上的多余细菌材料烧掉后,从第一组划线引出第二组划线,接种环灭菌,再从第二组划线引出第三组划线,如此反复3~4组划线后,即可把整个平板表面划满。一组划线的起点只能与邻近的上一组划线重叠,这样就可在最后的1~2组划线上出现多量的单个菌落,以便进行纯培养。

  

  划线完毕,烧灼接种环,将平皿盖好,用玻璃铅笔在平皿底部注明被检材料及日期,将平皿倒置于37℃温箱中,培养18~24小时后观察结果。

  

  (3)纯培养

  

  挑取可疑菌落进行染色、镜检,并将其同时接种在适宜的斜面上。

  

  (4)生化实验

  

  细菌都有各自的酶系统,因此,都有各自的分解与合成代谢产物,而这些产物就是鉴别细菌的依据。所谓细菌的生化试验,就是用生物化学的方法检查细菌的代谢产物。本试验的方法很多,常用的方法有:

  

  糖发酵试验 将纯培养菌接种于各种糖培养基中,置37℃培养1~7天,多数细菌在24小时即可观察结果。产酸+(培养基变黄);产酸产气⊕(培养基变黄并有气泡产生);不分解-(培养基仍为蓝紫色)。

  

  甲基红(MR)试验 将纯培养菌接种于葡萄糖蛋白胨液中,培养4~5天后,加甲基红试剂1~5滴于培养物5.0毫升中,呈红色者为甲基红试验阳性反应,黄色者为阴性反应。

  

  V-P试验 取2~4天的葡萄糖蛋白胨培养物2.0毫升,先加6%α-萘酚酒精液1.0毫升,再加40%氢氧化钾液0.4毫升,充分摇动试管,在数分钟内出现红色者为阳性反应,如为阴性,应在37℃温箱中放置4小时再观察,若出现红色者为阳性反应,仍为无色者为阴性反应。

  

  吲哚试验(靛基质试验) 取待测细菌接种在蛋白胨水中,置37℃温箱培养1~2天,向培养物中慢慢加入靛基质试剂0.5~1.0毫升,不要摇动,使其形成明显两层,即试剂重叠于培养物之上,注意观察培养物与试剂交接面上的变化,呈红色者为吲哚试验阳性,无变化者为阴性反应。

  

  硫化氢试验 取细菌纯培养物穿刺接种于醋酸铅琼脂或三糖铁琼脂内,于37℃培养1~2天,如沿穿刺线有黑褐色者,即为硫化氢阳性反应。

  

  枸橼酸盐利用试验 将细菌做成盐水悬液,接种1环于枸橼酸钠琼脂斜面上,置37℃培养4天,每天观察生长与否,阳性者有细菌生长,培养基从绿色转变为蓝色;阴性者不见有细菌生长,培养基仍为绿色。

  

  根据可疑菌的生化特性接种各种生化培养基进行生化试验,观察其生化反应特性。必要时可进行血清学试验。

  

  (5)动物致病性实验

  

  将该菌的24小时肉汤培养物接种实验动物,观察数天可知其致病性。

  

  (6)综合以上实验结果,即可确定病原菌的种类和名称。

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